自2010版药典开始，每五年一次的药典升级都对微生物检验的要求上一个台阶，留在记忆里的2015版药典升级前的那些日子仍旧历历在目，让我们在2020版药典升级前回顾一下2015版升级前的那些点滴，以准备迎接即将到来的2020版。

【备注】

以下文章为2015年编写，仅为了抛砖引玉。

1、自查2015版是否做到位做扎实；

2、其中有些应对方法（该方法指的是管理和应对策略）可对2020版的升级准备有所启发和借鉴。

ROUND 5

2015版中国药典微生物项变化的应对策略—设备（一）

依据以下条款，15版药典微生物项对设备方面的挑战大的是以下2大设备：无菌检查用隔离器（若企业决定使用B+A请自动忽略）和微生物鉴定系统，余下就是已有设备的增减，如培养箱、生物安全柜、超净台等。

1、《9203 药品微生物实验室质量管理指导原则》中“环境”项下的提到“微生物实验的各项工作应在专属的区域进行，以降低交叉污染、假阳性结果和假阴性结果出现的风险。无菌检查应在B级背景下的*单向流洁净区域或隔离器系统中进行，微生物限度检查应在不低于D级背景下的B级单向流空气区域内进行。*和B级区域的空气供给应通过终端高效空气过滤器（HEPA）”。

2、《9206 无菌检查用隔离系统验证指导原则》

3、《9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则》中“5.微生物鉴定”中提到“建议对受控环境收集到的微生物进行适当水平的鉴定，微生物菌群信息有助于预期常见菌群，并有助于评估清洁/消毒规程、方法、清洁/消毒剂及微生物监测方法的有效性，尤其当超过监测限度时，微生物鉴定信息有助于污染源的调查。关键区域分离到的菌落应先于非关键区域进行鉴定。”

4、《9204 微生物鉴定指导原则》

5、《1101 无菌检查法》、《1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》、《1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》中霉菌及酵母菌的复苏及供试品培养温度及控制菌的培养温度有所变化。

一、 无菌检查用隔离器

国内现在使用隔离器用作无菌检查的企业还是很少的，ag真人国际官网是12年进行的隔离器招标，当时使用的企业更少，当时我是个27岁的女孩子，对于设备的了解大家也可想而知，硬着头皮打了很多电话去各个企业和药检所咨询品牌和使用情况，上海地区也是*的几家企业有，因为预算的关系终选定国产厂家的双人四手套的单面硬体层流式的隔离器。

这里我确实有话要说，而且是发自肺腑的，我想很多企业设备部的老大都会说这种东西又没有什么技术含量，就几块铁皮拼拼起来要那么贵吗？但是实际使用和沟通下来，无菌检查用的隔离器真的有别于生产线上的隔离系统，它的细节设计会决定无菌检查实验的成功率，做过无菌检查的人都知道，很多供试品的操作和在套筒上的操作是需要精细化的，这就和生产线上很大程度上区分开来，所以隔离器的前期调研和设计太重要了！这里我不得不提一句，如果企业预算足够的话，我个人建议购买国外品牌的隔离器，当然这个品牌在隔离器的生产特别是无菌检查隔离器的生产方面要有一定经验，这样对客户要求的理解、设备的定制设计、后续的验证、实际使用时碰到的问题和定期维保等都会有非常大的帮助，而且其验证的工程师等都非常有经验，连客户大装载的在隔离器内的摆设位置等都给你设计好并且是有理有据的。我有一次邀请一位国外的隔离器生产厂家的销售人员来我们公司针对我们使用的隔离器聊了一个多小时，真的深有感触，他能把很多技术问题解释得很清楚，这点来说国内真的还有很长的一段路要走，因为外观很容易模仿而且非常容易做的很漂亮，但是设计的细节和人员的技术能力相信还是需要些年头的，希望国内的生产企业能够加快步伐。

基本现在市面上的无菌检查用隔离器都是定制款，因为要根据客户的一次大检验量等需求进行设计和定制，当时我们在设计要求方面因为经验不足确实留下了一些后续工作，虽然都能处理，但是个人觉得还是有不尽如人意的地方。以下就我的个人经验，选几个比较重要的点讨论一下：

1、 放置环境

《9206 无菌检查用隔离系统验证指导原则》中写到“无菌检查用隔离器安装环境的洁净度要求建议不低于我国现行GMP中D级空气洁净度要求”。

首先得考虑隔离器放置的环境是否能够满足该台隔离器（如有需要配备传递舱也一并考虑）的放置，应保证安装地点周围有足够空间，至少满足正常物品的传送以及一些正常维保维护的需要。如果使用集成的灭菌设备，已经集成在隔离器内部那问题不大，若使用移动式的必须考虑其放置位置；如果内部接入在线粒子和在线浮游探头进行检测，应考虑外置设备的放置位置；如果隔离器设置稳压电源，则应考虑稳压电源的放置位置，尽量以保证隔离器正常运行但是不占用室内空间为原则，事先应进行考虑和设计布置。

若放置在洁净区中，如果隔离器是室内采风，那洁净室的HEPA设置在什么位置，其风量多大能够保证隔离器和洁净室内都能够维持要求的洁净水平，隔离器的放置位置不能正对下风口且不能挡住出风口，应尽可能少的影响室内气流走向。

若放置在非洁净区，必须考虑房间温湿度的控制，如过氧化氢的灭菌会依赖室内采风的室内温湿度。

若隔离器需要接入压缩空气（密封圈密封、气动闸等）或水（清洁腔体）等介质，则需要考虑放置环境是否需排布相应的管道以满足需要。

2、 材质

现在市面上基本接触到的有三种：不锈钢、硬质塑料和软质塑料，前两种即所谓硬舱体，后一种是软舱体，第二种硬质塑料曾经接触过一家国外的厂家使用的，样机的照片非常可爱（女同胞们会比较喜欢），是标准化的配制加组合式的销售。硬体和软体其实各有特点，硬体一般舱内会选用316不锈钢，舱外会选用304不锈钢，软体一般为无毒PVC（聚氯乙烯）材质（应注意厚度）。

软体的优势在于视觉观察范围及清晰度优于硬体，但是时间久了膜容易老化需要定期更换整个膜体；人员手部的活动不像硬体那么受限，可以更好的拿取舱体内物品，操作更舒适；价格优势也是非常重要之一。

硬体的密封性相较于软体有一定优势，若腔体内使用尖锐物品不慎可能不需要担心是否会破坏舱体的密封性；另外硬体的清洁较软体的好进行，毕竟软体清洁时支撑点可能无硬体那么实感；再者硬体的视觉及使用感官上较软体来的扎实，可能这个属于中国人的传统观念。

其实主要还是看各个企业自己的实际需要和预算的水平。

3、 空气处理系统

这个在指导原则中讲的已经比较清楚了，无论是层流还是湍流都是要保证，在静态时，隔离器内部环境的洁净度要达到现行GMP中*的要求，因在操作过程中可能会产生颗粒，所以在动态时未做要求，同时对空气速率和换气次数也未作要求。

在使用杀菌剂灭菌时，隔离器需密封严实以确保泄入周围环境的挥发剂或气体维持在相当低的水平，当与外界环境想通的门被打开时（即灭菌完毕通风时），隔离器内部必须维持正压以保证无菌环境不被污染。

通常情况下，隔离器一般对周围环境应维持正压，正常操作时，压差范围为20-50Pa（USP1208规定：压差一般在20Pa或以上，使用时压力不得超过厂家建议的限值），这里为什么要提一下，因为有些国内的隔离器厂家可能没有对药典的要求那么关注，所以大家一定在前期把这个要求提出来，在后阶段的验证时，压差是一个很重要的关注点。

4、 仪器仪表

这里我仅列举大家常用的进行探讨，各自实验可能需要的其他仪器仪表就按各自需求进行评估购买。

1）、仪器

置于隔离器内的仪器基本就是灭菌设备、集菌仪、浮游菌探头、粒子探头、手套检漏仪。

现在很多的隔离器都是选用过氧化氢灭菌的，也不排除有使用臭氧和过氧乙酸灭菌的，设备可以集成在隔离器内部，也可以使用分体式的，这种分体式的也可以用来进行洁净室灭菌，当然灭菌要考虑洁净室大小。过氧化氢的灭菌技术我在这里就不作说明了，各家有各家的特点，但一定要注意的是腔体内温湿度的控制还有就是灭菌气体发生器的进气与排气的管路的在设备运行时的开闭。

集菌仪基本都会在购买隔离器的同时进行合并购买，并让厂家做在隔离器内部进行使用，那集菌仪放置的位置就相当重要，若一人操作，集菌仪可能就放在中间，若双人操作，集菌仪可能放置在主操手的位置，这点是非常关键的，直接影响实验人员的使用感受（人家操作的不舒服实验的质量就一并打折扣），在设计时就应该好好考虑，同时应考虑操作人员手的长度是否够得到集菌仪上的关键操作位置，还有非常非常重要的一点！就是集菌仪的排水口设计在哪里？这点其实相当的重要也需要进行实际测量。如果隔离器的下水口和集菌仪排液的管口是使用硅胶管连接的，那硅胶管如果有一定的弯曲死角，供试品实验时排水就会不畅，废液累积在排液槽一方面上端排液有问题，另一方面若排液槽内有微生物那因为废液的液面高度可能会污染套筒底部。所以集菌仪不单是那么简单的嵌入隔离器内部即可，其一些配套原件的设计位置也是需要重点考虑的。这里再额外提一下排水的问题，因为排水的问题会导致隔离器内腔与外部会有一个孔，那有很多人可能就会想到密封性的问题，这里我咨询过一个外企用了7、8年隔离器的公司，他们是这么解决的，ag真人国际官网隔离器后续也借鉴他们的使用方法，一般隔离器的使用流程是密封性测试→灭菌通风→实验操作，在开启隔离器运行之前，就将隔离器下端的排水孔上的硅胶管与排液桶相连，排液桶使用的是可灭菌PP材质，桶的盖子是悬口的，上面打两个孔，让其变成一个二通盖子，A通连接呼吸器，B通连接从隔离器下端排水孔连接下来的硅胶管，在使用前将桶盖盖好，B通的硅胶管顶部用牛皮纸或锡箔纸包好，整个桶进行灭菌，灭菌完毕将B通的硅胶管与隔离器下水孔连接，并将B通的硅胶管夹住封闭。操作好上述步骤即进行隔离器的运行步骤，进入可实验操作的阶段，将B通的硅胶管放开进行排液，这样操作对于密封测试及灭菌步骤均无影响，且正常实验时舱体为正压，且排液桶已经过灭菌，降低外接物品对舱体的影响。

对于环境检测的设备，浮游菌和粒子的探头也是需要考虑布置在何处的，这个必须经评估得出，如果预算有限，无法配制相应的监测设备，则在隔离器的设计时可以先预留至少三个外接口以备后续使用。当然也必须通过其他手段在实验中监控微生物，如放置沉降碟、表面微生物或擦拭取样等。

手套检漏仪这个设备我个人觉得没有很大意义，检测原理和腔体内的密封性测试一样，反正我们当初也买了，也就是定期检测下手套，指导原则也推荐了微生物的检测方法就是手套浸入0.1%的蛋白胨水然后薄膜过滤，大家可以根据需要选择是否购买。

2）仪表

隔离器作为无菌实验环境的保证，其需要控制的参数不少，那仪表就是非常重要的一个输出工具，压力表、温湿度探头、风速探头、灭菌剂的高低浓度探头等。

我们隔离器经过一次运行，ag真人国际官网关注的参数有压力、温湿度、风速和过氧化氢高低浓度。温湿度探头位于操作舱体内用于监测舱体温度及湿度；风速探头位于操作舱内的高效过滤器下端，用于监测舱体风速（我们是层流式的）；过氧化氢高浓度探头位于操作舱内过氧化氢喷淋头边，用于监测灭菌时舱体内过氧化氢浓度；过氧化氢低浓度探头位于设备出风口处，用于监测过氧化氢排空浓度，当该浓度＜1ppm时，设备自动进入生产模式，即可进行实验操作；以上4个探头在设备运行过程中均可实时监控并可打印数据曲线。

在指导原则上明确表示“需对隔离器的仪器仪表，比如过氧化氢传感器、温湿度传感器、压力传感器等进行定期校验”，其实这里我也有个困惑，就是过氧化氢传感器，现在计量院没办法进行校验，要送到国外去原厂校验，而且这个传感器又是比较重要的，要么企业自备2个传感器，要么和供应商商量让其常备在校验有效期内的传感器，不知道大家是如何解决的。

5、软件

隔离器的软件相当重要，这是体会的一点，FAT前就必须和厂家详细沟通，程序如何控制，程序运行的稳定性，程序运行时需监控的参数以及运行完毕后可打印的报告及曲线等，目的就是确认供应商能将自己想实现的东西在软件上实现。ag真人国际官网在隔离器边有一个触摸屏可以控制和调阅参数，同时在普通房间也连接电脑可以实时监控隔离器运行时的情况，并在运行完毕后贮存一些电子数据。

6、隔离系统的验证

这个真的是难讲的一部分，在药典的指导原则上也都是讲一些原则性的东西，没有特别细节的，大家其实可以参考USP1208，上面对于隔离器的3Q比CP稍微详细一点，现就比较重要的2点和大家作个探讨。

1） 灭菌参数的确认

一般验证工程师会根据客户的满载量确定一个灭菌参数，如灭菌剂流量、是温度控制还是时间控制、灭菌剂在腔体内的驻留时间等等，这里我们需要考虑的是，ag真人国际官网腔体内的满载放置是否会影响到灭菌剂对腔体内各个外表面微生物的杀灭情况，其实内部物品（如支架、设备、手套）的放置位置都会影响到灭菌剂在腔体里的浓度分布，其实这个时候可以使用化学指示剂对可能难以杀灭的部位进行布点，化学指示剂使用起来比较方便，灭菌剂对微生物杀灭几个log，其色卡就会相应有所变化。

当然化学指示剂可以作为参考，终定性的还是生物指示剂，生物指示剂应使用灭菌剂相应的挑战菌株进行试验，如过氧化氢灭菌剂，在药典的灭菌法中明确使用嗜热脂肪芽孢杆菌进行挑战，在使用前至少应确认其孢子含量是否达标，对于D值现在药典还未规定（听说正式版在推进这个事情，后续还结果不清楚），但在一些外企已规定需要测定D值。生物指示剂在腔体内的摆放位置很有讲究，一些未成功灭菌的点可能是因为指示剂摆放有误造成，一般指示剂的外包装是Tyvek，里面含滤纸片或不锈钢片，因滤纸片可能会吸收灭菌剂导致有一定残留，一般推荐使用不锈钢片。当在隔离器中放置时，印有字体的一面应朝向气流，不能阻塞该面，理想上，其放置位置应能让气流经过Tyvek的两面；在使用Tyvek包装时，应注意使用胶布固定时不要遮盖Tyvek的表面，否则会阻碍气流；避免在Tyvek表面标记（因某些类型的笔墨会催化过氧化氢），通常应标记在胶布上；有些指示剂有仅需培养24h的，但还是建议培养时间满足7天，避免假阴性结果。ag真人国际官网在这里必须提一句的是，大家一定要筛选质量合格可靠的生物指示剂，供应商或者代理商的专业程度也是相当重要的，国外有些指示剂商品也真的不怎样，前期的孢子含量测定等非常重要，要用数据说话！

灭菌确认符合要求后，灭菌报告的监控数据必须设置一定的合格范围以便日常使用时确认灭菌效果，如灭菌剂注入流量、温湿度、灭菌浓度、计算灭菌剂使用量等，这个是按各企业的灭菌剂不同及灭菌剂量时间的不同进行确认。

2） 包装完整性测试

这里的包装完整性测试的前提必须包括里面物品能承受的大灭菌次数以及在腔体内的holding time。举个例子，如果物品置于腔体内灭菌，不进行大灭菌次数的测试，则里面的物品仅可使用一次，测试完毕，不管用过或未使用的物品均需处理不可进行二次使用。做这个验证需要考虑，可能腔体内样品可承受的大灭菌次数，一般为2次，另外灭菌完毕后的holding time是多久，比如今天灭菌实验是第二天做，那就必须考虑样品及其他物品在腔体内的存放时间。设计好大灭菌次数及holding time后，根据灭菌参数对腔体内物品灭菌2次后放置估计的长时间，然后再进行包装完整性测试，测试通过后，今后使用时，内部物品经灭菌2次后必须处理不得使用（即灭菌1次还可使用），物品灭菌完毕后在腔体内的存放时间不得大于验证的holding time。

基本置于隔离器内的物品在之前应进行评估是否密封以防止灭菌剂的侵入，但有些物品可能没有使用的先例，需要进行挑战实验，在挑战之前，有一个小方法可能可以辅助确定是否有过氧化氢渗入，这个方法我没有用过，也是比较老师培训时推荐的，大家有兴趣可以试用下，比较简单易行，但后续的渗入确认还是需要传统微生物的方法进行挑战，如使用新的瓶子，可以在里面装入WFI，进行灭菌前后pH的测试，若下降则说明有一定渗入。

包装完整性测试指导原则上明确注明参照1101无菌检查法进行，进行无菌实验的供试品、稀释液、冲洗液、培养基、套筒，经灭菌后按无菌检查方法制成供试品管，按规定培养基的挑战菌制备定量的新鲜菌液接入供试品管即可，ag真人国际官网是在制备好供试品管后在阳性室接入阳性菌的，也有企业直接将在冲洗液中加入定量的新鲜菌液，经隔离器灭菌及holding time后直接按无菌检查方法接入供试品管中，这样挑战更大，但是若菌株不生长，可能无法判断是否是因为菌株经过灭菌及存放时间后死亡还是灭菌剂渗入导致的问题，当时接入的量也必须同步确认。

在隔离器内使用的平板等，尽管平板厂家可能提供相应的防止过氧化氢等一些灭菌剂渗入的证明报告，但是其验证时的剂量和时间和实际使用自己隔离器的剂量和时间不一致，所以我们必须还是要确认，这个也可以使用促生长实验进行灭菌前后的确认。

无菌检查用隔离器的筛选、验证及日常使用维护等其实是非常繁琐的过程，如果有新的包装或检品进行无菌检查必须进行包装完整性测试进行确认，若未配套传递装置，其满载量必须考虑的非常周全，对于隔离器的使用我也是新人，所以该篇文章仅描述我们实验室的使用情况和一些经验，大家可挑选相关内容作为参考并结合各自企业特点进行隔离器的筛选及管理。