细胞计数仪验证

1．细胞计数仪概述

细胞计数仪是用来进行细胞浓度检测的仪器，目的是为了明确培养的细胞在某一时间段的密度，及时补充营养液，以便其能够良好生长，一般以每毫升细胞数（细胞/ml）来表示计数结果。那么这就需要测量死细胞和活细胞的浓度，在细胞中，细胞死亡是正常的，总细胞数中活细胞所占的百分比称为细胞活力，也可叫做存活率。对细胞活力的应用可用于对复苏后细胞冻存和复苏效果的检测，也可用于在组织中对细胞进行分离时是否存在损伤的检测。现在常用的对细胞死活的辨别方法是通过使用台盼蓝，台盼蓝染色的原理是活细胞不会被染色，而死细胞能够染色，另一个是荧光染色法来鉴别。细胞计数仪有两个重要的功能，一个是计数，另一个就是对细胞是否死亡的判断。目前市场上有两类细胞计数仪：一类是明场细胞计数仪仅需简单的台盼蓝染色，另一类是荧光场细胞计数仪，需要相应的荧光染料。

2．细胞计数仪的原理

(1)      台盼蓝染色原理（明场细胞计数仪）：台盼蓝是细胞跨膜染料，活细胞膜结构完整，台盼蓝无法通过，细胞呈中心透亮具有明显的轮廓。死细胞膜通透性改变，台盼蓝可跨过死细胞膜进入细胞内，使细胞颜色加深，呈现实心的圆点与活细胞中心透亮轮廓清晰有明显的差异，根据这种形态的差异可以明显区别活细胞和死细胞进行区别计数。

(2)      AO/PI 荧光染色原理（暗场细胞计数仪）：AO/PI 为细胞核染料，AO 为吖啶橙是一种小分子染料，可以跨过所有细胞膜进入细胞内，使有核细胞标记上绿色荧光。PI 是碘化丙啶一种大分子染料，只有细胞死亡膜通透性改变后才能跨膜进入细胞内，使死细胞的核标记上红色荧光。AO/PI 染细胞后，死细胞会同时染上 AO 和 PI，AO 的发射光波长 532 nm 左右，PI 的激发光波长刚好与 AO 发射光波长相重，两种染料同染上死细胞核时会发生荧光共振能量转移，AO 的发射光被 PI 吸收，所以死细胞只会显示红色荧光，而活细胞只有绿色荧光。因此，通过特异性染色的细胞上标记的红色荧光和绿色荧光就可以快速辨别出死细胞和活细胞。

注：AO/PI试剂由可以发出绿色荧光的DNA结合染料吖啶橙（AcridineOrange，简称AO）和可以发出红色荧光的DNA结合染料碘化丙啶（Propidiumiodide，简称PI）组成。

3．为什么细胞计数仪要做验证呢？

首先应该明确做验证的目的，就是为了保证使用的仪器检测出的结果数据准确、可信。细胞计数仪是用来检测细胞数目的仪器，对其准确度要求很高，比如它的重复复现结果的能力、稳定性等等。新仪器使用前以及仪器使用一段时间后都需要对其进行验证，保证检测细胞数目的结果准确、可信，就必须对它的安装、环境等各部分系统要求进行验证，以证明该仪器符合检测的目的和要求，产生的误差也在规定范围内。那么仪器验证就是对仪器各功能进行检测、验证使其满足使用者的要求。这就需要通过设计合理的预试验来验证该仪器是否符合检测样品的规定要求，复现性怎么样、准确度会不会有偏移，结果是否可信等。所以仪器验证就是为了保证所检测出的结果是否可信、准确，这是很有必要的，只有经过验证的仪器，确保该仪器各部分都在良好的情况下才能用于细胞数目的检测。

4．细胞计数仪验证项目

（1）安装确认

a. 文件确认

b. 附件确认

c. 安装环境确认

d. 安装情况确认

（2）运行功能确认

a. 运行功能确认

b. 软件控制功能测试

（3）性能确认

a. 准确度测试

b. 线性关系测试

c. 重复性测试

d. 细胞活率判定测试

5．注意事项

(1)      每次使用前检查检出室或检出器细孔是否被污染，检出器细孔是否被损坏，细胞计数定量隔膜泵和检出器之间的管道是否堵塞等；

(2)      取样计数前，充分混匀细胞悬液，使分散成单个细胞；

(3)      如果感觉细胞数量较多时，可以从细胞悬液中吸取10μL至100μL，用少量PBS稀释后再作计数；

(4)      上机前注意检查是否有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中；

(5)      所用的稀释器、吸样管要经过校准；

(6)      检测前试样混匀很重要，如果无旋转式混匀器应颠倒混匀至少8次；

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华谱&泽恒是专注于为生物制药行业提供实验室仪器计量校准、GMP验证服务/3Q验证/设备确认/厂房验证的专业服务商。ag真人国际官网给制药客户解决的是一站式QC/QA/工程/验证等事业部的质控外包服务。

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