流式细胞仪校准方法

1. 流式细胞仪的概述

流式细胞仪由液流系统、光学系统、检测系统和分析系统四部分组成。测量原理是鞘液和样品流在喷嘴附近组成个圆柱流束，与水平方向的激光束垂直相交，染色的细胞受激光照射后发出荧光或产生散射光，这些信号分别被光电倍增管荧光检测器和光电二极管散射光检测器接收，经过计算机储存、计算、分析这些数字化信息，就可得到细胞的大小、活性、核酸含量、酶和抗原的性质等物理和生化指标。主要应用于分析细胞内抗原物质、细胞受体、肿瘤细胞的DNA、RNA含量等方面。

2. 术语

等量可溶性荧光分子（MESF）：颗粒发出的荧光信号强度相当的可溶性荧光素分子的物质的量浓度。用于表示颗粒发出的荧光信号强度。

3.流式细胞仪校准

（1）环境条件

室温为（15~30）℃，室内相对湿度：≤70%。

（2）校准使用标准物质

a.  单一荧光强度的荧光微球标准物质；

b.  多重荧光强度混合荧光微球标准物质；

c.  计数荧光微球标准物质；

d.  淋巴细胞计数标准物质。

注：校准时应采用有证标准物质，相对扩展不确定度不超过20% (k=2)。

（3）校准项目

a.  外观检查

b.  分辨力

c.  线性相关系数

d.  检出限

e.  漂移

f.  重复性

g.  示值误差

（4）外观检查

用目测、手动法进行检查。

（5）分辨力校准

a.  仪器经预热，进入正常工作状态；

b.  在装有0.5 mL经过0. 22 μm滤膜过滤的磷酸盐缓冲液的试管中，移取0.5 mL单一荧光强度的荧光微球标准物质，充分混匀后上机实验；

c.  记录前向角散射光和488 nm激发下两个荧光通道，包括绿色荧光（FITC 异硫氰酸荧光素）、橙红色荧光（PE藻红蛋白）；

d.  收集门内有效信号10000个，计算前向角散射光和两个荧光通道中校准微球峰宽的相对标准偏差，即为分辨力。

（6）线性相关系数校准

a.  在装有1mL经过0.22μm滤膜过滤的磷酸盐缓冲液的试管中加入20μL多重荧光强度混合荧光微球标准物质，充分混匀后上机实验；

b.  记录488 nm激发下绿色荧光（FITC）、橙红色荧光（PE）通道信号；

c.  对试验结果进行直方图分析，荧光强度从低到高至少5种不同的荧光强度峰，每个峰收集10000个门内有效信号，得到每个峰的平均荧光强度；

d.  根据校准微球标准物质证书提供的各个峰的等量可溶性荧光分子（MESF），将各峰的MESF取对数lg（MESF），简化表示为y，各峰测量的平均荧光强度取对数lg（FITC）或lg（PE），简化表示为x，将两者线性回归得到方程y=kx+b，计算两个通道的线性相关系数（r）。

（7）检出限校准

a.  针对绿色荧光（FITC）和橙红色荧光（PE）荧光通道，采用线性相关系数中得到的线性回归方程y=kx+b；

b.  计算无荧光标记的空白微球的平均荧光强度值对应的MESF即为荧光检出限。

（8）漂移校准

a.  将周围环境温度控制在允许范围（设定温度±3℃）内，在装有1 mL经过0.22 μm滤膜过滤的磷酸盐缓冲液的试管中，加入数滴单色荧光微球标准物质，充分混匀后上机试验；

b.  记录前向角散射光和488 nm激发下绿色荧光（FITC）、 橙红色荧光（PE）通道的信号，收集10000个以上门内有效信号；

c.  测试完成后，利用直方图分析试验结果，计算标准微球的平均荧光强度值；

d.  连续开机2 h后，在相同流式细胞仪设置和荧光通道电压值的条件下重复前述试验步骤，得到标准微球的平均荧光强度值；

e.  计算相对漂移率来表示稳定性。

（9）重复性校准

a.  首先制备取100 μL淋巴细胞标准物质，按比例添加抗原决定簇CD4抗体，轻柔涡旋充分混匀，避光存放半小时，使CD4抗体与细胞充分结合；

b.  将淋巴细胞标准物质标记好CD4抗体后上机测试，收集10000个以上门内有效信号；

c.  重复测量6次，依次记录每次测量的CD4阳性细胞占总淋巴细胞的百分比，计算CD4阳性细胞数量占总淋巴细胞的百分比的相对标准偏差，作为重复性的评价。

（10）      示值误差校准

按照测量重复性实验中得到的CD4阳性细胞占总淋巴细胞的百分比，计算平均值，然后计算示值误差，最后评估示值误差校准不确定度。

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